种植体周围炎炎性组织差异表达基因的筛选及验证

doi:10.12307/2023.802

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4844-4849.doi: 10.12307/2023.802

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种植体周围炎炎性组织差异表达基因的筛选及验证

韦雨杏1，董皓2，韦惠平2，谢诚2，陀杨娟2，覃浩2，曹勇1，2

1广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院，广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西颅颌面畸形临床医学研究中心，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医学科学院/广西壮族自治区人民医院口腔颌面外科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2022-09-19 接受日期:2022-10-31 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-03
通讯作者: 曹勇，医学博士，副主任医师，广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院，广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西颅颌面畸形临床医学研究中心，广西壮族自治区南宁市 530021；广西医学科学院/广西壮族自治区人民医院口腔颌面外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:韦雨杏，女，1996年生，广西壮族自治区河池市人，壮族，广西医科大学在读硕士，主要从事口腔种植修复研究。
基金资助:
广西自然科学基金(2018GXNSFAA050088)，项目负责人：曹勇；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目(S2021048)，项目负责人：曹勇

Screening and verification of differentially expressed genes in inflammatory tissues with peri-implantitis

Wei Yuxing1, Dong Hao2, Wei Huiping2, Xie Cheng2, Tuo Yangjuan2, Qin Hao2, Cao Yong1, 2

1College of Stomatology/Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Guangxi Academy of Medical Sciences/People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-09-19 Accepted:2022-10-31 Online:2023-10-28 Published:2023-04-03
Contact: Cao Yong, MD, Associate chief physician, College of Stomatology/Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Guangxi Academy of Medical Sciences/People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wei Yuxing, Master candidate, College of Stomatology/Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2018GXNSFAA050088 (to CY); Medical and Health Technology Development and Promotion Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. S2021048 (to CY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

种植体周围炎：是指种植体周围以软组织感染和周围骨质吸收为特征的炎症性疾病，是造成口腔种植修复失败的常见疾病。
差异基因：是指在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因。通过挖掘某疾病的差异基因，为进一步探索疾病发生发展的潜在分子机制提供理论依据。

背景：种植体周围炎严重影响着口腔种植修复的成功，目前仍然没有有效的治愈方法，其发病机制也尚未阐明。
目的：寻找种植体周围炎发生相关的核心差异表达基因，并进行实验验证。
方法：利用生物信息技术从GEO数据库中筛选种植体周围炎牙龈和健康牙龈的差异表达基因，并对差异基因进行富集分析。利用String数据库构建蛋白互作网络，并使用cytoscape软件筛选关键基因，采用 RT-PCR和免疫组化检测对关键基因C3AR1表达进行验证。采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞破骨向分化后C3AR1 mRNA的表达水平。

结果与结论：①将GSE33774数据集中种植体周围炎牙龈和健康牙龈的基因数据行差异分析，得到有意义的上调基因33个，下调基因17个，共50个差异表达基因；GO和KEGG结果显示差异表达基因主要富集在免疫受体活性、C-C趋化因子受体活性功能，以及破骨细胞分化相关信号通路上；②共筛选出C3AR1、CD14、TLR4、CCR1、CYBB和FCGR2A 6个关键基因，RT-PCR、免疫组化实验结果证实，C3AR1在种植体周围炎组织中表达上调，且C3AR1在巨噬细胞破骨向分化后表达上调；③结果显示，C3AR1在种植体周围炎中高表达，可能是种植体周围炎骨质破坏的关键基因。

https://orcid.org/0000-0001-9281-8501(韦雨杏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 种植体周围炎, C3AR1, 生物信息学, 差异表达基因, 关键基因, 单核巨噬细胞, 破骨分化, 骨质破坏

Abstract: BACKGROUND: Peri-implantitis seriously affects the success of dental implant restorations. There is still no effective cure and its pathogenesis has not yet been elucidated.
OBJECTIVE: To find key differentially expressed genes related to the occurrence of peri-implantitis and experimentally verify them.
METHODS: Differentially expressed genes between the peri-implantitis and the healthy gums were screened from the GEO database using bioinformatics technology and were analyzed by enrichment analysis. A protein interaction network was constructed using the String database. Key genes were screened by Cytoscape software. Expression of key gene C3AR1 was validated using RT-PCR and immunohistochemistry. The expression level of C3AR1 mRNA in RAW264.7 cells after osteoclast differentiation was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The gene data of peri-implantitis and the healthy gums in the GSE33774 data set were analyzed for differences. A total of 50 differentially expressed genes were obtained, including 33 upregulated genes and 17 downregulated genes. GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis showed that differentially expressed genes mainly played a role in immune receptor activity, C-C chemokine receptor activity, and the signaling pathway of osteoclast differentiation. (2) Six key target genes were identified based on the protein interaction network, including C3AR1, CD14, TLR4, CCR1, CYBB, and FCGR2A. The results of RT-PCR and immunohistochemistry experiments showed that the expression of C3AR1 at mRNA and protein levels was significantly increased in peri-implantitis tissue. Moreover, C3AR1 was upregulated after osteoclastic differentiation of macrophages. (3) It is concluded that C3AR1 showed high expression in peri-implantitis, which may be a key gene for bone destruction in peri-implantitis.

Key words: peri-implantitis, C3AR1, bioinformatics, differentially expressed gene, key gene, mononuclear macrophage, osteoclast differentiation, bone destruction

中图分类号:

韦雨杏, 董皓, 韦惠平, 谢诚, 陀杨娟, 覃浩, 曹勇. 种植体周围炎炎性组织差异表达基因的筛选及验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4844-4849.

Wei Yuxing, Dong Hao, Wei Huiping, Xie Cheng, Tuo Yangjuan, Qin Hao, Cao Yong. Screening and verification of differentially expressed genes in inflammatory tissues with peri-implantitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4844-4849.

图/表（结果） 7

2.1 差异表达基因筛选将GSE33774数据集中种植体周围炎牙龈和健康牙龈的基因数据行差异分析，得到有意义的上调基因33个，下调基因17个，共50个差异表达基因。并利用差异表达基因绘制火山图(图1A)和热图(图1B)。

GO结果显示，在分子功能上，差异表达基因主要富集在免疫受体活性、细胞因子受体活性及C-C趋化因子受体活性功能(图2A)；在生物学过程中，差异表达基因主要参与吞噬、树突状细胞趋化、正向调节血管生成和脉管系统发育等过程(图2B)。
KEGG结果显示，差异表达基因主要参与吞噬体、冠状病毒病-COVID-19、利什曼病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、中性粒细胞胞外陷阱形成、白细胞跨内皮迁移、酒精性肝病、结核、军团菌病及破骨细胞分化(图2C)。

2.3 蛋白-蛋白互作网络和关键基因筛选在String 数据库输入50个差异表达基因，以最低置信度为> 0.4为条件得到23个差异表达基因用于蛋白-蛋白互作网络的构建(图3A)。然后，通过cytoscape 内置的 MCODE 应用程序对重要的基因模块进行聚类，模块由 6个基因/节点组成(图3B)。这6个基因全为上调基因，包括C3AR1、CD14、TLR4、CCR1、CYBB和FCGR2A。

2.4 C3AR1 mRNA在种植体周围炎组织中高表达见图4。
GSE106090数据集分析结果显示，种植体周围炎中C3AR1 mRNA表达水平显著高于健康牙龈(P < 0.05)(图4C)。共收集了10例种植体周围炎牙龈组织样本(图4A，B)及10例健康牙龈组织样本，各样本均符合纳入及排除标准。
RT-PCR检测结果显示，与健康牙龈组织样本相比，种植体周围炎牙龈组织样本中C3AR1的mRNA表达水平显著增高(P < 0.05)，见图4D。

2.5 C3AR1蛋白在种植体周围炎组织中高表达见图5。

苏木精-伊红染色观察10例种植体周围炎及10例健康牙龈组织的组织形态，结果显示：相对于健康牙龈(图5A、E)，种植体周围炎牙龈固有层中炎症细胞浸润增加(图5B、F)。免疫组化染色结果显示，C3AR1在种植体周围炎牙龈组织中阳性表达(图5D、H)高于健康牙龈组织(图5C、G)(P < 0.05)，结果见表1所示。

2.6 C3AR1在巨噬细胞破骨向分化后表达上调 RAW264.7细胞诱导培养5 d后进行染色，在显微镜下可以看到抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞生成，见图6A。RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，实验组C3AR1 mRNA水平显著上调(P < 0.05)，见图6B。

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引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析结合RT-PCR和免疫组织化学实验验证。
1.2 时间及地点实验于2022年5-8月在广西医科大学口腔医学院实验室完成。
1.3 材料种植体周围炎基因组数据集来源于GEO(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo)数据库。训练集GSE33774数据集来自于GPL6244平台，共有22个样本，其中包括8个健康和7个种植体周围炎牙龈组织样本。验证集GSE106090数据集来自于GPL21827平台，共有18个样本，其中包括6个健康和6个种植体周围炎牙龈组织样本。
收集2021年5月至 2022年5月于广西壮族自治区人民医院口腔颌面外科就诊的10例种植体周围炎患者因治疗需要切除的病变软组织，男6例，女4例，年龄(54.29±9.13)岁。10例正常对照来源于同院牙冠延长术患者所切除的健康牙龈组织，男3例，女7例，年龄(31.21±8.17)岁。将收集的每份牙龈组织分成2份，一份放入液氮中保存，用于后续RT-PCR实验；另一份放入40 g/L多聚甲醛固定液(上海，碧云天)中固定保存，用于后续免疫组织化学实验。
所有患者均签署实验知情同意书。项目实施得到广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准(伦理编号：KY-LW-202111)。
种植体周围炎样本纳入标准：按照2017年牙周病和植体周病国际分类研讨会共识报告中定义的种植体周围炎诊断标准进行病例筛选[10]。①对于有初始资料的患者：存在探诊出血或溢脓，与以往的检查相比探诊深度增加，骨改建后存在牙槽嵴顶水平的骨吸收；②对于没有初始资料的患者：探诊出血或溢脓，探诊深度≥6 mm，植体周围骨吸收的量≥3 mm。
种植体周围炎样本排除标准：存在可能影响骨代谢或愈合能力的其他疾病；口腔内存在颌骨囊肿、骨髓炎等局部颌骨病变或其它感染灶。
正常对照样本纳入标准：牙龈呈粉红色，质地坚韧；牙齿无明显菌斑、软垢和牙石。
1.4 方法
1.4.1 差异表达基因筛选根据GPL6244和GPL21827平台构建的信息，首先将探针识别符号转化为正式的基因符号，随后去掉非mRNA探针，对同一基因的多个探针进行处理，保留最显著基因表达值的探针。R语言的“affy”“affyPLM”及“limma”软件包用于筛选GSE33774数据集中健康组和种植体周围炎组之间的差异表达基因，筛选条件为|log2FC|≥1和adj.P(adjust Pue) < 0.05。利用R语言“ggplot2”软件包绘制差异表达基因的热图和火山图。
1.4.2 GO功能富集与KEGG通路富集分析为了进一步研究差异基因的功能和作用途径，利用clusterprofiler软件包对差异表达基因进行基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)与基因本体论(gene ontology，GO)分析。GO分为分子功能(molecular function，MF)、生物学过程(biological process，BP)及细胞成分(cellular component，CC)3类。运用“org.Hs.eg.db”软件包进行注释转换，最后通过“dplyr”“ggplot2”软件包以及ChiPlot在线软件(https://www.chiplot.online/)绘制气泡图。
1.4.3 构绘蛋白互作网络及筛选关键基因 String网站是一种常用的在线分析基因与蛋白之间相互作用的网络工具。首先将差异基因输入到String数据库，将显著阈值设置为最低交互得分> 0.4(低置信度)。然后，使用cytoscape 软件构建蛋白互作网络(protein-protein interacion network，PPI)。接着，采用 cytoscape中的MCODE插件筛选蛋白互作网络的模块，筛选出关键基因。
1.4.4 关键基因的表达验证
基因芯片数据验证关键基因C3AR1的表达水平：提取GSE106090数据集中C3AR1的表达数据，利用SPSS 25.0软件和GraphPad-Prism 9软件进行统计学分析和结果可视化。
RT-PCR验证关键基因C3AR1 mRNA 表达水平：取约 100 mg 种植体周围炎牙龈及健康牙龈新鲜组织进行研磨，按照RNA提取试剂盒(北京，索莱宝)及反转录试剂盒(江苏，诺维赞)的说明提取RNA并合成cDNA，然后采用实时荧光定量 PCR 检测仪(美国，Thermo Fisher Scientific)进行检测。反应条件如下：预变性 95 ℃ 30 s；PCR 循环为 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；扩增循环40次。以 GAPHD 基因作为内参，2-ΔΔCt 计算法计算C3AR1的相对表达量。引物序列如下，GAPDH上游：5’-TGT TCG TCA TGG GTG TGA AC-3’，下游：5’-ATG GCA TGG ACT GTG GTC AT-3’；C3AR1 上游5’-TAA GTG TGG GGA CCA GAC AG-3’，下游：5’-GAG CAA AAC AGG CTA A-GCA C-3’。
免疫组化验证关键基因C3AR1的蛋白表达水平：将种植体周围炎及健康牙龈组织用40 g/L多聚甲醛固定液(上海，碧云天)固定，全自动脱水机脱水，石蜡包埋，制作组织切片，苏木精-伊红常规染色；将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(上海，源叶)，用高压锅加热进行抗原修复，牛血清白蛋白(北京，索莱宝)37 ℃封闭15 min；滴加稀释的一抗兔抗山羊C3AR1 IgG(1∶200，北京，博奥森)，4 ℃过夜，滴加兔抗山羊二抗IgG(1∶10 000，北京，博奥森)37 ℃下孵育20 min，DAB(北京，索莱宝)显色，苏木精复染、晾干封固，显微镜下观察C3AR1的蛋白表达水平。在400倍显微镜下观察、记录C3AR1阳性表达细胞数量，结果定义为：0，0%阳性细胞数；1，0% <阳性细胞数≤33%；2，33% <阳性细胞数≤66%；3，66% <阳性细胞数；0-1为阴性表达，2-3为阳性表
达[11-12]。切片的染色结果由2位资深口腔病理学专家协商一致取得。
1.4.5 RT-PCR法检测RAW264.7细胞破骨向分化后C3AR1的表达从武汉普诺赛生命科技有限公司购入小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，用含体积分数10%胎牛血清(南京，维森特)和1%双抗(北京，索莱宝)的DMEM培养基(美国，Gibco)，在37 ℃。体积分数5%CO2培养箱内培养。取生长状态良好的RAW264.7细胞，以104/孔接种到24孔板，分为2组：①对照组：加入普通生长培养基；②实验组：在培养基中加入50 ng/mL RANKL(美国，PeproTech)。于第5天根据抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(南京，建成)进行染色，封固后光镜观察，鉴定TRAP阳性多核破骨细胞的形成。利用RT-PCR法检测RAW264.7细胞破骨向分化后C3AR1 mRNA的表达，详细方法如前所述。
1.5 主要观察指标种植体周围炎差异表达基因、差异表达基因功能、种植体周围炎患者C3AR1 mRNA和蛋白的表达水平，以及巨噬细胞破骨向分化后C3AR1 mRNA的表达。
1.6 统计学分析应用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料根据数据是否符合正态性分布，采用完全随机设计资料的独立样本t检验或者非参数检验；计数资料采用Fisher精确概率法，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经由广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

种植体周围炎是由牙龈卟啉单胞菌、放线菌等一系列微生物感染引起的，以种植体周围软硬组织炎症性病变为特征的疾病[13]。随着生物信息学的发展，越来越多的基于GEO公共数据库的研究被运用于探求种植体周围炎的核心差异表达基因[14-16]。此次实验通过生物信息学技术得到了种植体周围炎炎性组织中33个上调差异表达基因及17个下调差异表达基因。在 GO 功能富集分析中发现，差异表达基因主要行使免疫受体活性、细胞因子受体活性及C-C趋化因子受体活性功能。免疫反应在种植体周围炎发病及进展过程中起着重要作用[17]， Toll样受体(Toll like receptor，TLR)是免疫反应中的模式识别受体，通过调节免疫B细胞浸润、核因子κB受体激活因子配基(RANKL)/骨保护素表达比例和差异炎症因子的产生介导种植体周围炎骨丢失[18-19]。因此，通过免疫调控可以影响种植体周围炎的发展。
实验筛选出C3AR1、CD14、TLR4、CCR1、CYBB和FCGR2A共6个关键基因。CD14是脂多糖受体，研究表明CD14-159 C/T多态性与种植体周围炎相关[20-21]。TLR4和CCR1已被证明与种植体周围炎的炎症发生发展有关[22-23]。CYBB又称 NOX2，被认为是骨关节炎坏死性凋亡的关键基因[24]，且在慢性肉芽肿性患者中发现该基因存在突变[25]。FCGR2A的异常表达及等位基因变异与多种疾病的发生有关，如牙周炎[26]、类风湿性关节炎[27]、头颈部鳞状细胞癌等[28]。C3AR1是补体C3a的受体，也是7次跨膜G蛋白偶联受体，属于一种蛋白质编码基因，在各种免疫和炎症疾病中均发挥重要作用[29-31]。CD14、TLR4和CCR1在种植体周围炎中的作用已有明确报道。此外，LI等[16]发现，C3AR1作为种植体周围炎和类风湿性关节炎的串扰基因，揭示了两种疾病在转录水平上的相似性和潜在关系，但是并未对C3AR1在种植体周围炎中的表达进行验证，因此，对C3AR1做进一步的研究有可能发现种植体周围炎潜在分子机制的新线索。
通过对C3AR1进行GSE106090数据集、RT-PCR验证，发现C3AR1 mRNA在种植体周围炎组织中高表达，进一步证实了C3AR1上调与种植体周围炎的发生发展联系紧密。种植体周围骨质吸收的发生与严重的巨噬细胞来源炎症反应和破骨细胞形成增强有关[32]。KEGG通路富集结果显示，差异表达基因主要参与破骨细胞分化相关信号通路。单核巨噬细胞的破骨向分化在种植体周围炎的发生发展过程中发挥重要作
用[33-35]。研究表明，牙周组织中多种炎症相关的免疫细胞可以表达C3AR1，其中C3AR1主要表达于巨噬细胞中[36-37]。此次实验免疫组化染色结果显示，种植体周围炎牙龈组织高表达C3AR1，这可能与大量的巨噬细胞破骨向分化相关。任飞龙等[38]研究发现C3a-C3aR 轴调控巨噬细胞的 M1型极化，促进慢性牙周炎的炎症反应和组织损伤。此次实验结果表明，C3AR1在RANKL诱导的单核/巨噬细胞形成破骨细胞中表达增加，提示C3AR1可能通过调控单核/巨噬细胞的破骨向分化参与种植体周围炎骨质破坏的发生。
综上所述，实验通过生物信息学筛选出种植体周围炎有价值的差异表达基因C3AR1，进一步实验证实了C3AR1在种植体周围炎组织中高表达，并且在单核/巨噬细胞的破骨向分化后表达上调。C3AR1可能是种植体周围炎骨质破坏的关键基因，为了解种植体周围炎骨质破坏的分子机制和探索种植体周围骨质缺损的有效治疗方法提供了新的思路，补充了种植体周围炎潜在调控基因网络。C3AR1在单核/巨噬细胞破骨向分化中的作用及C3AR1在种植体周围炎骨质破坏中的潜在分子机制有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

种植体周围炎炎性组织差异表达基因的筛选及验证

Screening and verification of differentially expressed genes in inflammatory tissues with peri-implantitis

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